RP-HPLC法同时测定鹿蹄草中齐墩果酸和熊果酸的含量
邬浩杰1，邹盛勤2（1.医院，浙江奉化；2.宜春学院化学与生物工程学院，江西宜春）
来源：《中国药房》杂志年11月第25卷第43期
摘要目的：建立同时测定鹿蹄草中齐墩果酸和熊果酸含量的方法。方法：采用反相高效液相色谱法。色谱柱为KromasilC18（mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇-水-磷酸（88∶12∶0.15，V/V/V），流速为0.9ml/min，柱温为30℃，检测波长为nm。结果：齐墩果酸进样量在0.～4.μg时，与峰面积积分值呈良好的线性关系（r＝0.，n＝6），平均加样回收率为98.6％，RSD＝2.1％（n＝6）；熊果酸进样量在1.～10.μg时，与峰面积积分值呈良好线性关系（r＝0.，n＝6），平均加样回收率为98.5％，RSD＝2.2％（n＝6）。结论：该方法操作简单、结果准确、重复性好，适用于鹿蹄草中齐墩果酸和熊果酸含量的同时测定。
鹿蹄草为鹿蹄草科植物PyrolacallianthaH.Andres或普通鹿蹄草P.decorataH.Andres的干燥全草，又名鹿衔草、破血丹等，具有祛风湿、强筋骨、止血、止咳等功效，临床上一般用于治疗风湿痹痛、肾虚腰痛、腰膝无力、月经量过多、久劳咳嗽[1]等。现代药理学研究表明，鹿蹄草具有明显的抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、降糖、降脂、保护心脑血管等作用[2]。鹿蹄草主要含有醌类、酚类、*酮类、三萜类等化学成分[3-4]，其中三萜类成分主要为齐墩果酸和熊果酸，两者互为同分异构体，通常以游离或结合为苷的形式广泛存在植物界[5]。齐墩果酸和熊果酸均具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗炎、抗菌、保肝等功效[6-8]。
目前，关于鹿蹄草化学成分的研究报道较多，但同时测定鹿蹄草中齐墩果酸和熊果酸含量的方法则鲜有报道。年版《中国药典》（一部）收载的鹿蹄草含量测定项下仅以水晶兰苷的含量为测定指标，而无其主要活性成分三萜酸类的含量测定标准[1]。为此，笔者建立了反相高效液相色谱（RP-HPLC）法同时测定鹿蹄草中齐墩果酸和熊果酸含量的方法，旨在为鹿蹄草的质量控制和进一步开发利用提供科学依据。
1材料
1.1仪器
HPLC仪，包括双泵、型光电二极管阵列检测器和Empower中文色谱数据工作站（美国Waters公司）；RO-MB-10D型高纯水机（杭州永洁达膜分离设备厂）；CPD型电子分析天平（德国Sartourius公司）；DHG-A型电热恒温鼓风干燥箱（上海恒科技仪器有限公司）；FY型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；SKHP型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，功率：W，频率：59kHz）。
1.2药材
鹿蹄草购自安徽、云南和江西，经宜春学院陈武教授鉴定为鹿蹄草科植物P.herba的全草。
1.3试剂
齐墩果酸和熊果酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为：-、-）；甲醇为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；乙醇为分析纯（江西洪都生物化学有限公司）；磷酸为分析纯（上海化学试剂有限公司一厂）。
2方法与结果
2.1色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：KromasilC18（mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-水-磷酸（88∶12∶0.15，V/V/V）；流速：0.9ml/min；柱温：30℃；检测波长：nm；进样量：10μl。以齐墩果酸和熊果酸计，理论板数均大于；分离度＞1.9；对称因子分别为1.03和0.99。色谱见图1。
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液分别精密称取齐墩果酸和熊果酸对照品2.31、5.32mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含每1ml含齐墩果酸0.mg和熊果酸0.mg的对照品混合溶液。2.2.2供试品溶液取鹿蹄草样品适量，置恒温干燥箱中于70℃下干燥6h，用高速粉碎机粉碎，分别精密称取鹿蹄草样品粉末各约3g（安徽：3.g，云南：3.g，江西宜春：3.g，江西樟树：3.g），分别置ml具塞锥形瓶中，加95％乙醇50ml，称定质量，超声提取1h，冷却，再次称定，用95％乙醇补足减失的质量，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.3线性关系考察
用微量注射器分别精密吸取齐墩果酸和熊果酸对照品混合溶液2.0、6.0、10.0、15.0、20.0μl，按上述色谱条件进样测定，记录峰面积，采用外标法进行定量分析。以对照品的进样量（x，μl）为横坐标，峰面积积分值（y）为纵坐标，进行线性回归，得齐墩果酸的回归方程为y＝5.32×x－1.06×（r＝0.），熊果酸的回归方程为y＝5.04×x－9.07×（r＝0.）。结果表明，齐墩果酸和熊果酸进样量在0.～4.60μg、1.～10.μg范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。
2.4精密度试验
分别精密吸取对照品混合溶液10μl，按上述色谱条件平行进样5次，记录色谱图。结果，齐墩果酸和熊果酸峰的RSD分别为0.9％和0.7％（n均为5），表明仪器精密度良好。
2.5重复性试验
取同一鹿蹄草样品（安徽）6份，每份各约3.0g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件进样测定，记录色谱图，采用外标法计算样品含量。结果，齐墩果酸和熊果酸含量的RSD分别为1.2％和0.9％（n均为6），表明该方法的重复性良好。
2.6稳定性试验
取同一供试品（江西宜春）溶液，分别于0、2、4、8、12、16、20h按上述色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，齐墩果酸和熊果酸的RSD分别为1.3％和0.7％（n均为7），表明供试品溶液至少在20h内稳定。
2.7加样回收率试验
精密称取已知含量的同一鹿蹄草样品（江西宜春）适量，共9份，每份各约1.5g，按高、中、低质量浓度分别加入齐墩果酸和熊果酸对照品适量，再按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录色谱图，重复3次，计算加样回收率，结果见表1。
2.8样品含量测定
精密吸取4批鹿蹄草样品（安徽、云南、江西宜春和江西樟树）制备的供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，每批平行测定3份，记录峰面积，计算样品含量。结果，4批样品中齐墩果酸的质量分数分别为0.％、0.％、0.％、0.％（n＝3），熊果酸的质量分数分别为0.％、0.％、0.％、
0.％（n＝3）。
3讨论
由本试验结果可知，不同产地的鹿蹄草中两种三萜酸的含量存在一定差异，其中江西樟树产样品中齐墩果酸和熊果酸的质量分数最高，分别为0.％和0.％；云南产样品的质量分数最低，分别为0.％和0.％。齐墩果酸和熊果酸均属于五环三萜类化合物，结构和极性相似，因此在色谱柱上的保留时间相近而难以完全分离。本试验采用RP-HPLC法，以甲醇-水-磷酸（88∶12∶0.15，V/V/V）为流动相，同时测定了鹿蹄草中的两种三萜酸类成分齐墩果酸和熊果酸，柱效高，分离度均＞1.9，且峰形对称，可以有效地丁桂活医院自制制剂，在临床已有50多年的使用史，疗效确切。该制剂由延胡索、羌活、独活、当归、木香、山奈、红花、川芎、白芷、续断、细辛、冰片、樟脑等中药组成，具有通经活络、逐风散寒的功效，一般用于跌打损伤、运动创伤中后期，症见关节疼痛、肌肉酸楚、麻木等。为了提高该制剂的疗效，我院结合现代药剂学知识，将丁桂活洛膏改将两者分开。综上所述，本方法简单、准确，精密度和重复性良好，可为鹿蹄草药材的质量控制提供科学依据。
参考文献（略）
本期责任编辑张静
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